eISSN: 1897-4252
ISSN: 1731-5530
Kardiochirurgia i Torakochirurgia Polska/Polish Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery
Current issue Archive Manuscripts accepted About the journal Supplements Editorial board Reviewers Abstracting and indexing Contact Instructions for authors Publication charge Ethical standards and procedures
Editorial System
Submit your Manuscript
SCImago Journal & Country Rank
1/2011
vol. 8
 
Share:
Share:

Protein p53 in non-small lung carcinomas

Grzegorz Wyrobiec
,
Wojciech Rokicki
,
Katarzyna Stęplewska
,
Janusz Kasperczyk
,
Olga Stępień-Wyrobiec
,
Daniel Sabat
,
Krzysztof Helewski

Kardiochirurgia i Torakochirurgia Polska 2011; 8 (1): 77–82
Online publish date: 2011/04/13
Article file
Get citation
 
 

Wstęp



Białko p53 – produkt genu p53, zostało odkryte w roku 1979 jako cząsteczka wiążąca się z dużym antygenem T, pochodzącym z wirusa SV40. Masa cząsteczkowa białka p53 wynosi 5300 (stąd nazwa genu i jego produktu). Białko p53 w warunkach fizjologicznych bierze udział w procesach kontroli i regulacji cyklu podziałowego, replikacji DNA i różnicowaniu komórek oraz w determinowaniu zaprogramowanego obumierania komórek (apoptozy). Ponadto badania ostatnich lat wskazują, że białko to poprzez hamowanie transpondyny 1 odgrywa istotną rolę w regulacji angiogenezy [1–5]. W cyklu komórkowym rola białka p53 polega na hamowaniu przejścia cyklu z fazy G1 przez fazę S w fazę G2 w momencie uszkodzenia nici DNA. W wyniku tego zatrzymania cyklu komórka ma czas na naprawę uszkodzeń DNA i aktywację genów naprawczych. Gdy reperacja nie dochodzi do skutku, białko p53 przyczynia się do uruchomienia procesu apoptozy, co pozwala na wyeliminowanie nieprawidłowej komórki z organizmu. Działanie to zapobiega przekazywaniu uszkodzeń komórkom potomnym. Dzięki tej roli gen p53 i białko p53 niejednokrotnie są nazywane „molekularnym żandarmem” lub „strażnikiem genomu” [6–9]. W warunkach prawidłowych, przy użyciu metod immunohistochemicznych w komórce nie stwierdza się obecności białka p53, gdyż występuje ono w postaci kompleksu z innym białkiem – mdm2, przy czym białko p53 stanowi czynnik transkrypcyjny dla genu mdm2. Zmutowany gen p53 koduje białko niezdolne do aktywacji transkrypcji genu mdm2. Brak białka mdm2 oraz zmieniona budowa białka p53 prowadzą do gromadzenia się go w komórce [10–12]. Zmutowane formy białka p53 w przeciwieństwie do swojego prawidłowego odpowiednika, którego okres półtrwania wynosi 10–20 min, mają wydłużony okres półtrwania nawet do 7 godz. Wydłużony okres półtrwania prowadzi do akumulacji białka p53 w jądrach komórkowych, co umożliwia wykrycie go metodami immunohistochemicznymi. Metody immunohistochemiczne nie pozwalają wykryć prawidłowego białka p53, które w komórkach występuje w bardzo małych ilościach [13–16].

Cel pracy



Celem pracy jest próba znalezienia zależności pomiędzy liczbą komórek akumulujących białko p53 a typem histologicznym niedrobnokomórkowego raka płuc i wielkością guza nowotworowego. W pracy oceniano również wpływ wieku pacjentów operowanych z powodu niedrobnokomórkowego raka płuc na liczbę komórek akumulujących białko p53.



Materiał i metody



Badaniu poddano grupę 94 chorych w wieku 39–82 lat (średnia wieku wynosiła 63,7 ±7,1 roku), w tym 14 kobiet (14,8%) oraz 80 mężczyzn (85,2%), których operowano z powodu pierwotnego, niedrobnokomórkowego raka płuc w Klinice Chirurgii Klatki Piersiowej Wydziału Lekarskiego w Zabrzu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach w latach 1988–2006. Dobór pacjentów stanowiących badaną próbę był przypadkowy. Badania histopatologiczne i immunohistochemiczne przeprowadzono w Katedrze Patomorfologii Wydziału Lekarskiego w Zabrzu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Materiał do badania stanowiły wycinki guzów usuniętych w czasie zabiegów torakochirurgicznych, utrwalone w formalinie i przechowywane w postaci bloczków parafinowych.

Z każdego wycinka guza wykonano dwa preparaty, każdy o grubości 5 µm. Pierwszy preparat barwiono metodą standardową hematoksyliną i eozyną w celu weryfikacji rozpoznania histopatologicznego oraz w celu selekcji do dalszych badań. Drugi preparat przeznaczano do badań immunohistochemicznych. Barwienia immunohistochemiczne przeprowadzono trójstopniową metodą ABC (ang. Avidin-Biotin-Complex), zgodnie z zaleceniami producenta, z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych firmy Novocastra: p53 Protein (BP53-12). Skrojone skrawki na szkiełkach silanizowanych odparafinowano w ksylenie, a następnie po uwodnieniu gotowano w kuchence mikrofalowej w temperaturze 96oC w roztworze buforu cytrynianowego przez 1 min w celu odkrycia antygenu. Po ostudzeniu pojemnika z próbkami pod zimną wodą i przepłukaniu preparatów w letniej wodzie blokowano endogenną peroksydazę przy użyciu 3-procentowej wody utlenionej przez 5 min. Po wypłukaniu w buforze TBS przystąpiono do właściwego barwienia immunohistochemicznego z użyciem uniwersalnego kitu ABC firmy Novocastra.

Opis kolejnych etapów barwienia immunohistochemicznego przygotowanych preparatów:

1. Blokowanie niespecyficznych wiązań – inkubacja normalną (nieimmunizowaną) surowicą przez 10 min.

2. Inkubacja próbki w temperaturze 60oC przeciwciałem firmy Novocastra.

3. Płukanie w roztworze TBS – 2 × 5 min.

4. Inkubacja biotynylowanym przeciwciałem przez 30 min.

5. Płukanie w roztworze TBS – 2 × 5 min.

6. Inkubacja metodą ABC.

7. Płukanie w roztworze TBS 2 × 5 min.

8. DAB chromogen (wywołanie reakcji barwnej).

9. Płukanie w wodzie destylowanej przez 5 min.

10. Podbarwienie hematoksyliną przez 1 min.

11. Płukanie w wodzie bieżącej przez 15 min.

12. Odwodnienie w alkoholu, „prześwietlenie” w ksylenie i „zamknięcie” w balsamie kanadyjskim.

Przygotowane preparaty poddano ocenie mikroskopowej przy użyciu mikroskopu świetlnego Olympus BX50. Analizę mikroskopową przeprowadzono w następujący sposób:

W polu widzenia o powierzchni 0,950 mm2, w powiększeniu 400× analizowano 1000 komórek nowotworowych. Wyniki podano w postaci wskaźnika (liczba komórek z dodatnią reakcją jądrową na 1000 komórek nowotworowych). Jako dodatnią reakcję oceniano komórki, których jądra wybarwiły się na kolor ciemnobrązowy. Jako pozytywną kontrolę zastosowano dla oceny białka p53 wycinki gruczolakoraka jelita grubego.

Do analizy statystycznej użyto programu Statistica for Windows Version 8.0. Zastosowano testy statystyczne parametryczne dla wyników spełniających cechy rozkładu normalnego: analizy wariancji i test post hoc (test Scheffe) oraz testy nieparametryczne dla wyników niespełniających cech rozkładu normalnego: ANOVA Kruskala-Wallisa, wielokrotne porównania średnich rang dla wszystkich prób, test U Manna-Whitneya i korelacji porządku rang Speermana.



Wyniki



Akumulacja białka p53 a typ histologiczny guza



Stwierdzono istotnie większą liczbę komórek akumulujących białka p53 w gruczolakoraku w stosunku do raka płaskonabłonkowego (p = 0,003) oraz w gruczolakoraku w porównaniu z rakiem wielkokomórkowym (p = 0,010). Stwierdzono brak istotnej różnicy między rakiem płaskonabłonkowym i rakiem wielokomórkowym w zakresie akumulacji białka p53 (p = 0,887).



Wielkość guza a akumulacja białka p53



Dokonano podziału guzów na dwie grupy. Grupa I to guzy o średnicy do 3 cm, a grupa II to guzy o średnicy powyżej 3 cm. W grupie II stwierdzono istotnie statystycznie większą liczbę komórek akumulujących białka p53 w porównaniu z grupą I (p = 0,038).



Wiek pacjentów a akumulacja białka p53



Stwierdzono występowanie znamiennej statystycznie ujemnej korelacji pomiędzy wiekiem chorych operowanych z powodu niedrobnokomórkowego raka płuc a liczbą komórek akumulujących białka p53 (p = 0,041; r = –0,210).



Zaawansowanie kliniczne a akumulacja białka p53



Stwierdzono istotnie większą liczbę komórek akumulujących białko p53 w guzach o stopniu zaawansowania klinicznego IIIA i IIIB w stosunku do stopnia I (p < 0,01).



Dyskusja



W niniejszej pracy stwierdzono występowanie białka p53 w 100% niedrobnokomórkowych raków płuc. Wynik ten z pewnością wydaje się szokujący dla badaczy zajmujących się zaburzeniami funkcji genu p53 i występowaniem biał-

ka p53 w różnych nowotworach. Wyniki uzyskiwane przez

innych autorów badających białko p53 w niedrobnokomórkowych rakach płuc zamykają się w przedziale między

35–70% (najniższe uzyskane przez autorów z pracy Jassem i wsp. [2], najwyższe dane – z pracy Cynowska i wsp. [1]). Uzyskany przez autorów wynik tylko pozornie nie mieści się w wymienionym zakresie [2, 17]. Rozbieżności w uzyskiwanych rezultatach przez różnych autorów wynikają z braku jednolitych kryteriów interpretacji. W omawianym badaniu za dodatnie wyniki przyjęto próbki, w których ekspresja białka p53 była stwierdzana nawet w pojedynczych komórkach. Tymczasem aż w 35 przypadkach przebadanych guzów stwierdzono, iż barwieniu wykazującemu obecność białka p53 uległo mniej niż 1% komórek. W 17 przypadkach stwierdzono występowanie 3–5 komórek akumulujących biał-

ko p53. Gdyby jednak jako wynik dodatni przyjęto tylko te próbki, w których stwierdzono co najmniej 10% wybarwionych komórek (kryterium przyjęte przez Ebinę i wsp. [18]), ekspresja białka p53 wynosiłaby 55,3%. W pracy badawczej Jassem i wsp. za wynik dodatni przyjęto próbki, w których obecność barwienia stwierdzono co najmniej w 25% komórek. Analogiczne kryterium przyjęte w omawianej pracy wykazuje ekspresję białka p53 już tylko w 51,1% przypadków [2, 18]. Tak więc uzyskany przez autorów wynik zawyżają głównie przypadki, w których stwierdzono pojedyncze komórki akumulujące białko p53. W celu przeprowadzenia analizy poszczególnych typów histologicznych raków pod względem akumulacji białka p53 przyjęto wyznacznik 25% jako wynik dodatni. Taki procent barwienia został przyjęty przez Jassem i wsp. dla badania populacji polskiej. Ustalenie kryterium wyników dodatnich jest ważne z tego powodu, iż uważa się, że częstość mutacji genu p53 i stopień akumulacji białka p53 jest zależny od rejonu geograficznego, w którym żyje badana populacja. W wyniku przeprowadzonej analizy stwierdzono, że najwyższy odsetek dodatnich wyników występował w rakach płaskonabłonkowych i wynosił 56,2%. Nieco niższy odsetek występowania białka p53 stwierdzono w gruczolakorakach (51,7%). Najniższy odsetek dodatnich wyników uzyskano w przypadku raków wielkokomórkowych – 35,2%. Na podstawie omawianego materiału badawczego interesujące wydaje się spostrzeżenie, iż w rakach o typie gruczołowym stwierdzono średnio znacznie więcej komórek akumulujących białko p53, a tymczasem najwyższy odsetek wyników dodatnich zaobserwowano w guzach o typie płaskonabłonkowym. Można więc wnioskować, iż raki płaskonabłonkowe akumulują biał-

ko p53 częściej, ale w mniejszej ilości niż gruczolakoraki. Podobne wyniki akumulacji białka p53 w różnych typach histologicznych raków uzyskali także inni autorzy, choć np. w pracach Jassem i wsp. nie stwierdzono ekspresji białka p53 w komórkach raków wielkokomórkowych. Rozbieżności występujące pomiędzy wynikiem ekspresji białka p53 w omawianym badaniu a wynikiem tych autorów mogą wynikać z faktu znacznie mniejszej grupy badanych guzów (5 raków wielokomórkowych) przez Jassem i wsp. w stosunku do 17 raków wielkokomórkowych w omawianym materiale [1, 19–21]. Na różnice wyników pomiędzy badaczami zajmującymi się białkiem p53 ma też niewątpliwie wpływ stosowanych przeciwciał, które różnią się miejscem wiązania cząsteczki białka p53. Ponadto większość z dostępnych aktualnie przeciwciał może wykrywać obecność zarówno prawidłowego, jak i nieprawidłowego białka p53. Wszystkie te elementy mogą w zasadniczy sposób wpływać na uzyskiwane wyniki [22].

Prowadząc analizę zależności między stopniem zaawansowania klinicznego a akumulacją białka p53 w komórkach niedrobnokomórkowych raków płuc, podzielono badane guzy na dwie grupy. Jedna z tych grup to guzy w stopniu zaawansowania I. W I i II stopniu zaawansowania raka płuc leczeniem z wyboru jest zabieg chirurgiczny. Z utworzonej przez autorów grupy wykluczono guzy w stopniu II ze względu na obecność przerzutów nowotworowych do węzłów chłonnych. Wybrano w ten sposób grupę guzów o najlepszym rokowaniu po zabiegu chirurgicznym. W grupie II umieszczono guzy w stopniu IIIA i IIIB, dla których leczeniem z wyboru jest radio- lub chemioterapia. W wyniku przeprowadzonej analizy stwierdzono występowanie istotnych statystycznie różnic pomiędzy guzami w I stopniu zawansowania w porównaniu z guzami w stopniach zaawansowania IIIA i IIIB w zakresie liczby komórek akumulujących białko p53. Na obrzeżu raków w wyższym stopniu zaawansowania (IIIA i IIIB) stwierdzono, iż dochodzi do większej akumulacji białka p53. Jeśli przyjąć, że liczba komórek akumulujących białko p53 ma niekorzystny wpływ na przebieg leczenia i rokowanie, to badanie immunohistochemiczne materiału pod kątem tego parametru może dostarczyć dodatkowych informacji na temat progresji procesu nowotworowego. Należy jednak zaznaczyć, iż dane dotyczące związku między występowaniem białka p53 a czasem przeżycia są kontrowersyjne. W większości prac nie wykazano zależności pomiędzy ekspresją białka p53 a czasem przeżycia. Istnieją także doniesienia, w których stwierdzono znamiennie korzystny, ale i znamiennie niekorzystny wpływ białka p53 na rokowanie [23–26]. Wydaje się, że dalsze badania na dużym materiale, z wykorzystaniem porównywalnych przeciwciał monoklonalnych mogą wyjaśnić rozbieżności w uzyskiwanych wynikach. Należy również brać pod uwagę wpływ innych niezależnych czynników, które mają wpływ na rezultaty przeprowadzanych do chwili obecnej badań.



Wnioski



U chorych na niedrobnokomórkowe nowotwory płuc wraz z wiekiem zmniejsza się liczba komórek guza akumulujących białko p53. Być może jest to jedna z przyczyn, dzięki której stwierdza się wolniejszą progresję procesu nowotworowego u osób starszych.

Gruczolakorak jest typem histopatologicznym niedrobnokomórkowego nowotworu płuc, przy występowaniu którego dochodzi do największego nagromadzenia białka p53 w komórkach nowotworowych guza. Obserwacja ta może stanowić wyjaśnienie dla większej agresji klinicznej raków o typie gruczołowym.

Piśmiennictwo



1. Cynowska B, Żółtowska A, Słomiński J. The expression of nuclear p-53 protein in lung cancer cells. Pol J Immunol 1994; 19: 121-126.

2. Jassem E, Góźdź S, Jassem J, Urbaniak A, Kobierska G, Damps I, Badzio A, Skokowski J. Występowanie białka p53 w komórkach niedrobnokomórkowego raka płuc. Nowotwory 1999; 1: 25-29.

3. Jassem E, Rosell R, Jassem J, Monzo M, Kobierska G, Badzio A, Roszkiewicz A, Skokowski J, Szulc A. Ocena wartości rokowniczej mutacji genu p53 u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuc. Pneumonol Alergol Pol 1998; 66: 290-295.

4. Wyrobiec G, Rokicki W, Stęplewska K, Kasperczyk J, Głowacka M. Komórki tuczne i angiogeneza w niedrobnokomórkowych rakach płuc. Kardiochir Torakochir Pol 2007; 4: 155-161.

5. Stępień-Wyrobiec O, Wyrobiec G, Rokicki W, Harabin-Słowińska M. Naczyniowy czynnik wzrostu śródbłonka (VEGF) – regulator angiogenezy. Ann Acad Med Siles 2007; 61, 2: 1-9.

6. Lane DP. p53 quardian of the genome. Nature 1992; 358: 15-16.

7. Miyashita T, Reed JC. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of human bax gene. Cell 1995; 80: 293-299.

8. Smith ML, Chen IT, Zhan Q, Bae I, Chen CY, Gilmer TM, Kastan MB, O’Connor PM, Fornace AJ Jr. Interaction of the p53-regulated protein Gaad45 with proliferating cell nuclear antigen. Science 1994; 266: 1376-1380.

9. Selivanova G, Wiman KG. Reactivation of mutant p53: molecular mechanisms and therapeutic potential. Oncogene 2007; 26: 2243-2254.

10. Manfredi JJ. The Mdm2-p53 relationship evolves: Mdm2 swings both ways as an oncogene and a tumor suppressor. Genes Dev 2010; 24: 1580-1589.

11. Waning DL, Lehman JA, Batuello CN, Mayo LD. Controlling the Mdm2-Mdmx-p53 Circuit. Pharmaceuticals (Basel); 3: 1576-1593.

12. Wyrobiec G, Stępień-Wyrobiec O, Kotulski R, Głowacka M. Białko p53 jako marker prognostyczny w wybranych nowotworach. Ann Acad Med Siles 2003; 54-55: 113-121.

13. Hall PA, Lane DP. P53 in tumour pathology: can we trust immunohistochemistry- Revisited! J Pathol 1994; 172: 1-4.

14. Jassem E, Góźdź S, Jassem J, Urbaniak A, Kobierska G, Damps I, Badzio A, Skokowski J. Występowanie białka p53 w komórkach niedrobnokomórkowego raka płuc. Nowotwory 1999; 1: 25-29.

15. Levine AJ, Momand J, Finlay CA. The p53 tumor suppressor gene. Nature 1991; 351: 453-456.

16. Rusin M, Niklińska W, Nikliński J, Chorąży M. Zaburzenia genów cyklu komórkowego w raku płuca. Nowotwory 1998; 48: 717-729.

17. Fijołek J. Ekspresja białek p53 i HER-2/neu oraz jej związek z odpowiedzią na chemioterapię u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuc. Pneumonol Alergol Pol 2003,; 71: 365-370.

18. Ebina M, Steinberg SM, Mulshine JL, Linnoila RI. Relationship of p53 overexpression and up-regulation of proliferating cell nuclear antigen with the clinical course of non-small cell lung cancer. Cancer Res 1994; 54:

2496-2503.

19. Brambilla E, Gazzeri S, Moro D, Caron de Fromentel C, Gouyer V, Jacrot M, Brambilla C. Immunohistochemical study of p53 in human lung carcinomas. Am J Pathol 1993; 143: 199-210.

20. Esposito V, Baldi A, De Luca A, Micheli P, Mazzarella G, Baldi F, Caputi M, Giordano A. Prognostic value of p53 in non-small cell lung cancer: relationship with proliferating cell nuclear antigen and cigarette smoking. Hum Pathol 1997; 28: 233-237.

21. Kojima H, Shijubo N, Abe S. Thymidine phosphorylase and vascular endothelial growth factor in patients with Stage I lung adenocarcinoma. Cancer 2002; 94: 1083-1093.

22. Casey G, Lopez ME, Ramos JC, Plummer SJ, Arboleda MJ, Shaughnessy M, Karlan B, Slamon DJ. DNA sequence analysis of exons 2 through 11 and immunohistochemical staining are required to detect all known p53 alterations in human malignancies. Oncogene 1996; 13: 1971-1981.

23. Harris CC. p53 tumor suppressor gene: from the basic research laboratory to the clinic-an abridged historical perspective. Carcinogenesis 1996; 17: 1187-1198.

24. Hayakawa K, Mitsuhashi N, Hasegawa M, Saito Y, Sakurai H, Ohno T, Mae­ba­yashi K, Ebara T, Hayakawa KY, Niibe H. The prognostic significance of immunohistochemically detected p53 protein expression in non-small cell lung cancer treated with radiation therapy. Anticancer Res 1998; 18:

3685-3688.

25. Dworakowska D, Gózdz S, Jassem E, Badzio A, Kobierska G, Urbaniak A, Skokowski J, Damps I, Jassem J. Prognostic relevance of proliferating cell nuclear antigen and p53 expression in non-small cell lung cancer. Lung Cancer 2002; 35: 35-41.

26. Dworakowska D, Jassem E, Jassem J, Karmoliński A, Lapiński M, Tomaszewski D, Rzyman W, Jaśkiewicz K, Sworczak K, Grossman AB. Prognostic value of the apoptotic index analysed jointly with selected cell cycle regulators and proliferation markers in non-small cell lung cancer. Lung Cancer 2009; 66: 127-133.
Copyright: © 2011 Polish Society of Cardiothoracic Surgeons (Polskie Towarzystwo KardioTorakochirurgów) and the editors of the Polish Journal of Cardio-Thoracic Surgery (Kardiochirurgia i Torakochirurgia Polska). This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), allowing third parties to copy and redistribute the material in any medium or format and to remix, transform, and build upon the material, provided the original work is properly cited and states its license.
Quick links
© 2024 Termedia Sp. z o.o.
Developed by Bentus.